ИФА. Цели его использования в диагностике инфекционных заболеваний.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Принцип метода напоминает РИФ, но вместо флуоресцирующей метки используется ферментная (чаще фермент пероксидаза).

1-ый вариант ИФА (направлен на обнаружение антигенов)

l Цели постановки:

1. Сероиндикация (АГ – молекулы на поверхности бактериальных клеток или вирусных частиц);

2. Идентификация вирусов (на третьем этапе вирусологического метода диагностики);

3. Определение уровней цитокинов, белков системы комплемента, онкомаркеров в сыворотке крови (в данном случае АГ – это сами молекулы цитокинов, онкомаркеров, белков системы комплемента и т.д.);

4. Иммуногистохимические исследования (определение специфических рецепторов на поверхности клеток тканевых срезов – антигенов).

Ставится в лунках планшета, ко дну которых заранее адсорбированы известные АТ против определённых АГ. Вносят исследуемый образец, инкубируют в шейкере, промывают буферным раствором. Далее в лунки вносят вторые антитела, меченные ферментом, вновь инкубируют в шейкере и промывают. После второй отмывки в лунки вносят субстрат-индикаторную систему, состоящую из субстрата для пероксидазы (перекись водорода) и цветового индикатора (например, ТМБ – тетраметилбензидин – окрашивает образец в синий цвет или ОФДА – ортофенилендиамин – окрашивает образец в коричневый цвет). Останавливают реакцию добавлением стоп-реагента (слабый раствор соляной или серной кислоты). Учёт реакции – по измерению оптической плотности содержимого лунок планшета с помощью спектрофотометра или ИФА-анализатора. Количество АГ в образце определяется по калибровочной кривой (график, где определённому содержанию АГ соответствует определённое значение оптической плотности раствора, измеряемое спектрофотометром или ИФА-анализатором). Калибровочные кривые строят предварительно по стандартам (фабричные растворы, содержащие заведомо известное количество того или иного АГ).

2-ой вариант ИФА (направлен на выявление антител)

l Цели постановки:

1. Серодиагностика (определение количества АТ против бактериальных, вирусных, протозойных, грибковых АГ в сыворотке крови);

2. Определение уровней иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови и других биологических жидкостях;

3. Определение уровней аутоагрессивных антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях (используется в диагностике аутоиммунных заболеваний).

К дну лунок планшета адсорбированы известные АГ (диагностикумы) к ним добавляют сыворотку крови пациента. (биологическую жидкость). Инкубируют в шейкере, промывают. Далее в каждую лунку вносят антиглобулиновую сыворотку (АГС), содержащую АТ к человеческим иммуноглобулинам, меченные пероксидазой, инкубируют в шейкере, затем промывают и вносят субстрат-индикаторную систему. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента (слабый раствор соляной или серной кислоты). Учёт реакции – с помощью спектрофотометра или ИФА-анализатора по измерению оптической плотности содержимого лунки планшета. Количество АТ в сыворотке крови определяется по калибровочной кривой (график, где определённому содержанию АТ соответствует определённое значение оптической плотности раствора, измеряемое спектрофотометром или ИФА-анализатором). Калибровочные кривые строят предварительно по стандартам (фабричные растворы, содержащие заведомо известное количество тех или иных АТ)

 

Реакция гемагглютинации (РГА)

¨ Используется только для индикации вирусов, содержащих гемагглютинины

¨ Ставится в лунках планшета

¨ Компоненты:

¡ жидкая питательная среда, в которой культивировали культуру клеток,

¡ взвесь эритроцитов

¨ Учет – по характеру осадка эритроцитов:

¡ при наличии вируса с гемагглютининами – “зонтик”,

¡ при отсутствии – “пуговка”.

¨ Если вирус обнаружен, то жидкость называется вируссодержащей жидкостью (ВСЖ)

РТГА для идентификации вируса

¨ ставится в лунках планшета

¨ компоненты реакции:

1. ВСЖ

2. специфическая противовирусная сыворотка

3. эритроциты

¨ Учет:

если сыворотка подходит к вирусу, то его гемагглютинины блокируются антителами, а значит не вызывают агглютинацию эритроцитов - осадок в виде “пуговки” (положительная реакция)

если сыворотка не подходит к вирусу, он агглютинирует эритроциты – осадок в виде “зонтика” (отрицательная реакция)

РТГА с целью серодиагностики ставится с «парными» сыворотками и считается положительной, если произошло увеличение титра АТ не менее чем в 4 раза. РТГА ставится только при вирусных инфекциях.