Й этап. Накопление вирусов (культивирование).

a) Одним из самых распространенных методов культивирования является метод тканевых и клеточных культур.

Культуры тканей стали активно использоваться с 50-х годов, когда в практику вошли антибиотики (прекратились бактериальные проросты ткани),были разработаны синтетические питательные среды, а главным стимулом послужило выявление ЦПД у вирусов.С 1954 года стали использовать метод однослойных культур тканей. Они используются в различных целях: для выделения вирусов, для их идентификации, для постановки реакций нейтрализации, гемадсорбции, для изучения динамики накопления вирусов, развития ЦПД, изучения репродукции вирусов и т.д.

Существует 3 типа тканевых культур:

· первично-трипсинизированные;

· полуперевиваемые;

· перевиваемые.

Первично-трипсинизированные культуры ткани получают из различных органов и тканей: кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, куриных, мышиных, из почек различных эмбрионов, из легких, из роговицы глаза кролика и т. д.

Этапы получения культуры клеток: измельчение источника; обработка трипсином; освобождение от детрита; стандартизация числа клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками; разлив в пробирки или флаконы.

Полуперевиваемые культуры – это штаммы диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 40-50 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают.

Перевиваемые клетки существуют вне организма очень долго. Они получены из нормальных тканей, из злокачественных эмбриональных – их сотни линий, но они не могут быть использованы для приготовления вакцин, так как способны вызывать опухоли. Почти все они эпителиоподобные, но есть и фибропластические. На культуре тканей размножается подавляющее большинство вирусов. Для выращивания к/ткани необходимы питательные среды.

b) Простым, весьма экономичным и эффективным методом является культивирование вирусов в куриных, реже утиных, эмбрионах.

Эмбрионы для выделения вирусов применяют с 1930 года. Преимущества: это закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов. У эмбрионов не образуются антитела, как в организме лабораторных животных, они доступны и дешевы. Они используются для выделения вирусов, титрования их, приготовления вирусных антигенов. Это хорошая модель для культивирования вирусов гриппа, герпеса, оспы, паротита, некоторых вирусов эн-цефалита. Используются эмбрионы разного возраста (от 5-7-дневного до 11-13-дневных) и разные методы заражения: в амнион, на хорион-аллантоисную оболочку – ХАО, в хорион-аллантоисную полость, в желточный мешок.

c) Редким, но иногда необходимым является биологический метод, в основе которого лежит инфицирование чувствительных лабораторных животных.

В основном используются белые мыши разного возраста, обезьяны (для вируса кори). При накоплении вирусов в организме животных мы можем также оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях.

2-й этап. Индикация вирусов.

  В культуре ткани:

Регистрация внутриклеточных включений, элементарных телец (см. Экспресс-диагностику) и ЦПД разных вирусов на культуру ткани:

При размножении вируса в культуре ткани происходят различные изменения, которые в конечном итоге приводят к гибели клетки. Сморщивание клеток, пикноз ядер, скручивание их, образование небольших очагов этих изменений наблюдается при энтеровирусной инфекции, полиовирусы тоже дают очень быстро ЦПД. Вирус может размножаться и не вызывать заметных изменений в клетке, тогда прибегают – к окрашиванию монослоя гематоксилин-эозином или другим гистохимическим методом и изучают тонкие изменения в ядрах и цитоплазме и т.д.

Реакция гемадсорбции: Все вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, способны вызывать гемадсорбцию. Если к культуре клеток, зара-женной вирусом добавить эритроциты, то они могут адсорбироваться на клетках, пораженных вирусом. Этот метод может служить для индикации вируса. Данный феномен наблюдается с вирусами клещевого энцефалита, гриппа, парагриппа, кори, паротита и т. д.

Реакция гемагглютинации: Вирусы, обладающие гемагглютинирующими антигенами, способны вызывать склеивание эритроцитов в пробирке или в лун-ках планшета. Агглютинацию эритроцитов могут давать некоторые вирусы, содержащие комплементсвязывающие антигены. В отличие от гемадсорбции, для гемагглютинации берется вируссодержащая жидкость (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкость, брюшинный экссудат и т.д.). Взвесь вирусов соединяется с взвесью эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих) и наблюдается феномен гемагглютинации на стекле или в объеме.

Цветная проба Солка: Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. Большинство питательных сред для культур тканей содержит индикатор – феноловый красный. В нейтральной стерильной среде индикатор имеет красный цвет. Если среда по каким-либо причинам принимает щелочную реакцию, то индикатор становится малиновым. В кислой среде феноловый красный становится желтым. При жизни клеток в культуре они выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При развитии вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. При это мы отмечаем задержку изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре.

В эмбрионах:

 Образование бляшек на хорион-аллантоисной оболочке.

Помутнение амниотической жидкости.

Реакция гемагглютинации: Для гемагглютинации берется вируссодержащая жидкость (амниотическая или аллантоисная жидкость). Взвесь вирусов соединяется с взвесью эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих) и наблюдается феномен гемагглютинации на стекле или в объеме.

В организме лабораторного животного:

Оценка клинических проявлений инфекции.

Оценка патоморфологических и патогистологических изменений.