Влияние рН среды на активность амилазы слюны

Содержимое каждой пробирки после прибавления слюны тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20^оС) на 15—20 мин. Через 10 мин. берут пробы из третьей пробирки, переносят на стеклышко и проделывают реакцию с каплями раствора Люголя. Вначале обычно получается синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное, красно-бурое, желтое. Как только содержимое третьей пробирки будет давать желтое окрашивание, через 1—2 минуты приливают во все пробирки по 1 капле раствора Люголя.

На основании полученной окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН среды.

Схема записи протокола опыта

№ пробирки	рН буферного раствора	Объем растворов для получения буферного раствора с заданным рН	Субстрат (крахмал) 0,5%	Фермент амилаза	Результат опыта с раствором Люголя (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)
1/15М дигидрофосфата калия	1/15М гидрофосфата натрия
	5,6	0,25	4,75
	6,2
	7,4
		4,75	0,25

Специфичность ферментов

Принцип работы: каждый фермент может катализировать только одну реакцию, действуя на одно вещество или ряд близко родственных веществ. Высокая специфичность - одно из наиболее характерных свойств ферментов. Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов и не оказывает никакого действия на дисахариды. В случае расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу реакция Троммера должна быть положительной. При расщеплении крахмала до глюкозы эта проба также положительна.

1. Работа проводится с 2 пробирками по следующей схеме:

 

Реактивы	№ пробирки	Результаты опытов по реакции (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)
		с раствором Люголя	с раствором Троммера
Крахмал	2 мл	-
Сахароза (1% раствор)	-	2 мл
Амилаза	0,5 мл	0,5 мл

 

2. Далее пробирки ставят на 10 минут в термостат при температуре 38^оС.

3. После термостатирования с содержимым пробирок проделывают реакции с йодом на присутствие крахмала и пробу Троммера на присутствие глюкозы:

1 мл исследуемого раствора + 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия + 5 капель 1% раствора сульфата меди.

Пробирку нагревают в кипящей водяной бане. При наличии глюкозы появляется желтое окрашивание, переходящее в красное.

 

Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

В данной работе исследуется влияние на каталитическую активность амилазы слюны хлорида натрия и сульфата меди.

Нумеруются три пробирки. В пробирку №1 наливают 1 мл воды; в пробирку № 2 - 0,8 мл воды и 0,2 мл. 1% раствора хлорида натрия, в пробирку № 3 - 0,8 мл воды и 0,2 мл 1% раствора сульфата меди.

Во все пробирки добавляют по 1 мл разведенной слюны и по 1 мл 0,5% крахмала и оставляют на 3 мин. при комнатной температуре. Затем проверяют действие ферментов в пробирке №2, где предполагается наибольшая активность амилазы. Для этого из пробирки №2 отбирают несколько капель и проделывают пробную реакцию с йодом; эту реакцию повторяют каждые 20—30 секунд, пока не получат оранжевое или желтое окрашивание. Затем добавляют йод в пробирки № 1, 2, 3. Отмечают окрашивание и записывают результаты в виде таблицы.

 

Схема записи протокола опыта

№ пробирки	Объем воды, мл	Модулятор	Фермент амилаза, мл	Субстрат (крахмал 0,5%), мл	Результат опыта по реакции с йодом (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)
		-
	0,8	0,2 мл хлорида натрия
	0,8	0,2 мл сульфата меди

Часть 2. Исследование химического состава слюны

Обнаружение анионов неорганических кислот

1. Ополоснув рот водой, собирают около 1 мл слюны в пробирку или флакончик и разводят тройным количеством дистиллированной или кипяченой воды. Отливают половину содержимого в другую пробирку и капают примерно десять капель раствора ляписа - нитрата серебра АgNОз (можно растворить в 1 мл воды половину ляписного карандаша из аптеки; примеси не помешают опыту).

2. К белому осадку, выпавшему в пробирке, добавляют конц. уксусную кислоту, и осадок частично растворится. Так при взаимодействии с нитратом серебра ведут себя соли соляной и фосфорной кислот - хлориды и фосфаты.

3. Вторую часть раствора слюны слегка подкисляют слабым раствором соляной кислоты и добавляют несколько капель 3%-ного раствора хлорида железа (III) FeСl₃. Красно-бурая окраска свидетельствует о том, что в растворе есть роданиды - соли роданистоводородной (HCNS) кислоты. В то время как в слюне у курильщиков мало амилазы, роданидов, напротив, больше обычного.