Проба Кумбса (антиглобулиновый тест)

Антиглобулиновая сыворотка (АГС) – сыворотка крови кролика содержащая антитела против человеческих иммуноглобулинов (IgG), получают иммунизируя кроликов (IgG) человека;

Неполные антитела -_(моновалентные или блокирующие антитела) имеют один активный центр и  не дают при соединении с антигеном видимых серологических реакций._Пример: резус-фактор

Варианты	Прямая проба Кумбса (одноступенчатая)	Непрямая проба Кумбса
Принцип	Реакция агглютинации для выявления неполных антител, фиксированных на поверхности эритроцитов.	Реакция агглютинации для выявления неполных антител в сыворотке крови
Исследуемый материал	Кровь из вены (взрослый пациент) или пуповинная кровь новорожденного	Сыворотка пациента
Диагностические препараты	АГС	1) Эритроциты группы 0 (I) Rh + 2) АГС
Нарисовать схему
Применение	1) Диагностика гемолитической болезни новорожденных (ГБН) 2) Выяснение причин гемолитической трансфузионной реакции 3) Диагностика гемолитических анемий, обусловленных аутоиммунными реакциями или некоторыми препаратами	1) Выявление неполных антител к эритроцитарным антигенам реципиента и донора перед проведением гемотрансфузии 2) Выявление анти-Rh-антител в крови матери 3) Диагностика приобретенной гемолитической анемии

3. Методы оценки В-системы.

►Количественная оценка.

Определение количества В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами мыши

Принцип метода: на 1 этапе из крови выделяют лимфоциты. На 2 этапе с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами мыши определяют процент В-лимфоцитов от общего числа лимфоцитов. При добавлении к суспензии лимфоцитов эритроцитов мыши, последние адсорбируются В-лимфоцитами, а образующиеся при этом структуры называются розетками. Общее количество лимфоцитов подсчитывают под микроскопом по количеству розеток.

 Кровь (10 мл) пациента вносят в пробирку с раствором гепарина и осторожно наслаивают на смесь фиколл-гипака, который способствует выделению лимфоцитов, и центрифугируют. После центрифугирования эритроциты оседают на дно пробирки, а лимфоциты располагаются тонким слоем на границе раствора фиколл-гипака и плазмы. Взвесь лимфоцитов осторожно извлекают из этого слоя (интерфазы), доводят до концентрации 4x10⁶/мл –4x10⁹/л) и смешивают с взвесью эритроцитов мыши в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение нескольких часов. Подсчет клеток производят в камере Горяева. Подсчитывают число “розеток” на 100 лимфоцитов и определяют процентное содержание В-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества В-лимфоцитов в день исследования производят общий клинический анализ крови. В норме содержание В-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 30 до 50% от общего количества лимфоцитов (в среднем 46,7±1,0%). Лимфоциты 19-37 % от общего числа лейкоцитов (4,0 – 9,0 х 10 ⁹ – в 1 л крови).

Препарат мазок крови Окраска по Романовскому Увеличение 900 Метод выявляет маркер CD 20 на поверхности В-лимфоцитов; Содержание В-лимфоцитов – (CD 20) = 8-20% от общего числа лимфоцитов.

►Качественная (функциональная) оценка

Определение концентрации иммуноглобулинов G класса в сыворотке крови методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (в реакции преципитации).

Принцип метода: на стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают агар, смешанный с антителами против IgG. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок вносят разведения стандартной сыворотки с известной концентрацией IgG. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных. Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре, образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от количества Ig в сыворотке крови. Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки, наносят на построенный график и определяют концентрацию Ig. Стандарт IgG = 10-20 г/л.- содержание в крови у человека.

Вывод: диаметр кольца преципитации равен (2,5 мм)² =6,25 концентрация иммуноглобулина ~ 5 г /л, т.е. она снижена (норма содержания в крови у здорового человека  IgG = 10-20 г/л).

Реакция Кумбса - это антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов. Данный метод был предложен английским врачом Робертом Кумбсом в 1945 году, в связи с чем впоследствии получил название "реакция Кумбса".

Антиглобулиновая сыворотка - реагент, необходимый для проведения теста Кумбса. В состав антиглобулиновой сыворотки входят антитела к иммуноглобулинам человека. Сыворотка взаимодействует с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, что приводит к их агглютинации.