Определение кальция в биологических жидкостях

Химическим методом.

Принцип метода:

Кальций образует с глиоксаль-бис-2-оксианилом в щелочной среде комплекс красного цвета, который определяют фотометрически.

Материал для исследования: сыворотка крови.

Реактивы:

1. Раствор едкого натра;

2. Метанол;

3. Глиоксаль-бис-2-оксианил;

4. Стандартный раствор кальция.

Приготовление реактива:

Глиоксаль-бис-2-оксианил растворяют в метаноле.

Ход определения:

Отмерить (мл)	Проба	Эталон	Контроль раствор
Дистиллированная вода Сыворотка крови Калибровочный раствор Раствор едкого натра	1,00 0,02 - 0,50	1,00 - 0,02 0,50	1,02 - - 0,50
Перемешивают и спустя 5-10 минут добавляют
Раствор глиоксаль-бис-2-оксианила	2,00	2,00	2,00
Перемешивают и между 5-ой и 15-ой минутой после добавления раствора глиоксаль-бис-2-оксианила измеряют оптическую плотность пробы (Dо) и эталона (Dст) против контрольного раствора. Длина волны 520-550 нм, кювета 1 см.

Расчет результатов:

                                 D_о

Кальций (ммоль/л) = ------ * С_ст

                                 D_ст

С_ст= 2,5 ммоль/л

Предупреждение:

Лабораторная посуда, применяемая при определении кальция, должна быть совершенно чистой и служить исключительно для данной цели. После обычного мытья посуду следует поместить на ночь в 2% раствор комплексона 3 в аммиачной воде 1+1, потом тщательно промыть бидистиллированной водой и высушить.

Меры предосторожности по ходу работы:

В реактиве 1 содержится хлористоводородная кислота, в реактиве 3 – натрия гидроокись, оба – едкие вещества. В реактиве 4 содержится метиловый спирт – особо опасный яд и горючее вещество.

Увеличение содержания кальция происходит при:

· Физиологической гиперкальциемии, наблюдается у новорожденных, а также у недоношенных детей;

· Избыточном введении в организм ребенка витамина Д
(передозировка);

· Злокачественных опухолях с метастазированием в кости и
без метастазирования;

· Гиперфункции паращитовидных и щитовидной желез;

· Акромегалии, гигантизме и т.д.

Уменьшение содержания кальция наблюдается при:

· Спазмофилии у детей;

· Рахите;

· Гипопаратиреоидизме (обычно после случайного удаления во
время операции на щитовидной железе);

· Хронической почечной недостаточности.

 

ЖЕЛЕЗО.

Железо в организме входит в состав порфириновых соединений, главным образом, гемоглобина и миоглобина, в небольших количествах оно включается в состав цитохромов, некоторых ферментов. Железо в сыворотке связывается белком трансферрином. Концентрация железа в сыворотке зависит от резорбции в желудочно-кишечном тракте, накопления в кишечнике, селезенке и костном мозге, от синтеза и распада гемоглобина и его потери организмом. Средние показатели железа ниже у женщин, чем у мужчин, но у тех и у других с возрастом показатель железа падает. Концентрация железа имеет суточный ритм, а у женщин - связь с менструальным циклом. При беременности содержание железа в организме уменьшается, особенно во второй половине беременности.

Нормальное содержание железа:

у женщин - 14-21,5 мкмоль\л,

у мужчин - 14-26,0 мкмоль\л.

Методы определение железа.

1. Батофенантролиновый метод;

2. Определение с феррозином.

Батофенантролиновый метод определения

Содержания железа в сыворотке крови.

Принцип метода:

Определение содержания сывороточного железа основана на его предварительном освобождении из белкового комплекса и последующем проведении цветной реакции с батофенантролином.

Материал для исследования: сыворотка крови.

Реактивы:

1. Стандартный раствор железа;

2. Батофенантролин;

3. Тиогликолевая кислота;

4. Раствор для осаждения белков.

Приготовление реактива:

Для приготовления раствора для осаждения белков в мерную колбу на 100 мл отмеряют 3 м тиогликолевой кислоты и добавляют до метки раствором для осаждения белков.

Ход определения:

№	Реактивы (мл)	Проба	Стандарт	Контроль
1. 2. 3. 4.	Сыворотка Стандартный раствор железа Раствор для осаждения белков Бидистиллированная вода	1,0 - 1,0 -	- 0,5 0,5 -	- - 0,5 0,5
Перемешивают пробу и через 5 минут центрифугируют при 3000 об/мин.
5. 6.	Надосадочная жидкость Батофенантролин	1,0 2,0	- 2,0	- 2,0

В пределе от 5 до 60 минут измеряют оптическую плотность опытной пробы и стандарта против контроля при длине волны 540 нм в кювете 5 мм.

Расчет результатов:

	Dо
Железо в пробе мкмоль/л =	------------	* Cст
	Dст

 

Определение с феррозином.

Принцип метода:

Железо, связанное в крови с трансферрином, освобождается хлоргидратом изанидина и восстанавливается аскорбиновой кислотой до ионов Fe²⁺. Ионы Fe²⁺ вступают в реакцию с хромогеном, образуя окрашенный комплекс. Интенсивность окраски образовавшегося соединения пропорциональна концентрации железа в пробе.

Материал для исследования: сыворотка крови.

Реактивы:

1. Буфер;

2. Хромоген;

3. Таблетки, содержащие аскорбинат натрия и тиомочевину;

4. Стандартный раствор железа.

Приготовление реактивов:

Реагент А: во флакон с буфером добавить 1 таблетку реагента.

Реагент В: во флакон с буфером добавить 1 таблетку реагента, 1 мл хромогена.

Ход определения:

№	Реагенты	Контроль	Опыт	Стандарт	Холостая проба
1. 2. 3. 4.   5.	Реагент А Реагент В Сыворотка Стандартный раствор железа      Дистиллированная вода	- 2,00 - -   0,04	- 2,00 0,04 -   -	- 2,00 - 0,04   -	2,00 - - 0,04   -

Содержимое пробирок тщательно перемешать. Инкубировать 5 минут при температуре 37ºС. Измеряют оптическую плотность опытной пробы и стандарта против контроля и холостой пробы против реагента А в течение 30 минут.

Расчет результатов:

Δ D_пробы = D_пробы – D_{холостой пробы}

Δ D_ст = D_ст – D_{холостой пробы}  

	Δ Dпробы
Концентрация железа =	------------	* Cст
	Δ Dст

С_ст = 17,9 ммоль/л