Методы амплификации ДНК и электрофоретическая детекция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - реакция матричного синтеза, в ходе которой происходит многократное копирование (амплификация) тестируемого участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов.

Разработке методики ПЦР сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать короткие одноцепочечные фрагменты ДНК - олигонуклеотиды, а также открытие термофильных микроорганизмов, живущих в горячих источниках (гейзерах). Ферментативная система экстремальных термофилов способна функционировать при высоких температурах. ДНК-полимераза этих организмов выдерживает многократное повышение температуры до 95˚С без потери биологической активности, что является необходимым условием для проведения ПЦР.

Итогом этого стала разработка сотрудником фирмы "Cetus" Кэри Мюллисом в 1983 г. полимеразной цепной реакции, за которую он в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии.

Особенно бурное развитие метод ПЦР получил в связи с программой "Геном человека", так как он позволил модифицировать методику секвенирования и ускорить процесс расшифровки последовательностеи ДНК.

Механизм ПЦР.

Компоненты реакционной смеси.

а. Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, состоящие как правило из 15-30 нуклеотидов, комплементарные 3'-концам анализируемых участков ДНК. Они являются начальными участками фрагментов ДНК, подлежащих амплификации. Обычно вводится два праймера, один из которых комплементарен началу одной цепи, другой - концу второй цепи.

б. Смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксирибоаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксирибогуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксириботимидинтрифосфата, (дТТФ) дезоксирибоцитидинтрифосфат (дЦТФ) - являющаяся материалом для синтеза новых цепей.

в. Taq-ДНК-полимераза - термостабильный фермент, выделенный из экстремально термофильной бактерии Thermus aquaticus, обеспечивающий матричный синтез 3'-конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности.

г. Реакционный буфер - смесь стабилизаторов, катионов и анионов, обеспечивающий оптимальные условия функционирования полимеразы.

д. Анализируемый образец - препарат ДНК, предположительно содержащий искомую нуклеотидную последовательность, подлежащую амплификации.

Этапы амплификации

Температурный цикл состоит из трех этапов:

1. Термическая денатурация (плавление цепей).

Анализируемый образец представлен двухцепочечной молекулой ДНК, а для проведения требуются одноцепочечные фрагменты. Для этого реакционная смесь нагревается до 92-95˚С, в результате происходит разрушение водородных связей между нуклеотидами и разделение цепей.

2. Отжиг праймеров.

При снижении температуры до 50-60˚С происходит присоединение праймеров к одноцепочечным фрагментам ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом Чаргаффа и принципом комплементарности, то есть если нуклеотидная последовательность праймера комплементарна последовательности анализируемой цепи, то отжиг произойдет, если некомплементарна – нет.

3. Элонгация (синтез цепей).

На этом этапе температура смеси доводится до 72˚С, что является оптимумом для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы, при этом синтез второй цепи идет с максимальной эффективностью и точностью.

Указанные этапы составляют один температурный цикл. В ходе ПЦР проводится до 30-35 циклов, что позволяет получить из одного участка ДНК до миллиона копий.

Важным событием явилось создание приборов-амплификаторов (термоциклеров), которые в автоматическом режиме, по специальной программе, осуществляют высокоточное регулирование температуры реакционной смеси и проводят ПЦР за 3-5 часов.

После открытия термостабильной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы, обратной транскриптазы) появилась возможность диагностики многих заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами (вирус гепатита С, пикорнавирусы, и др.).

Области применения ПЦР.

В настоящее время наиболее быстро развиваются шесть основных направлений ПЦР-диагностики.

1. Диагностика инфекционных заболеваний.

Это связано с тем, что в отличие от ИФА и других методов определения антигенов возбудителя, ДНК-диагностика позволяет непосредственно идентифицировать возбудителя заболевания по его геному.

2. Диагностика онкологических заболеваний.

После открытия онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста и исследований ученых в рамках проекта "Геном человека" появилась возможность определения активности этих генов и, тем самым, указывать на предрасположенность и даже наличие онкологического заболевания у обследуемого субъекта.

3. Диагностика генетических заболеваний.

В настоящее время разработаны тест-системы диагностики большого количества генетических заболеваний, например, муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна-Беккера и др.

4. Идентификация личности.

Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов является индивидуальной особенностью каждого человека (см. ПДРФ).

5. Определение генетической структуры главного комплекса гистосовместимости (HLA).

Представляет особую ценность при трансплантации органов и тканей, так как различие в структуре антигенов гистосовместимости, определяемое генетически, лежит в основе реакции отторжения трансплантата.

6. Диагностика патогенов в пище.

Эта отрасль ДНК-диагностики является пока самой скромной среди представленных, однако является перспективной, так как методы являются более точными, быстрыми и информативными.