Определение количества пировиноградной кислоты по Фридеману и Хаугену (Friedemann, Haugen, 1943)

Принцип метода. Пировиноградную кислоту осаждают в виде 2,4-динитрофенилгидразона; осадок этого гидразона очи­щают от примесей гидразонов других кетокислот последователь­ной экстракцией толуолом и содой. В содовом экстракте опреде­ляют пировиноградную кислоту колориметрическим методом.

Реактивы: 1) 5%-ная трихлоруксусная кислота;

2) 0,2%-нын 2,4-kинитрофенилгндразин;

3) 2 н. соляная кис­лота;

4) 10%-пая сода;

5) толуол;

6) пируват лития или нат­рия;

7) 1.5 н. едкий натр

Ход определения

Для количественного определения пировиноградной кислоты берут навески тканей 0,8 - 1,0 г, белки осаждают 9-кратным количеством охлажденной 5%-ной трихлоруксусной кислоты, смесь тщательно взбалтывают, охла­ждают и через 10 - 15 мин центрифугируют. Прозрачный центрифугат осторожно декантируют; 4 мл его, что соответствует 0,4 г ткани, переносят в конусные пробирки, содержащие 1мл0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина, и после 10 - 15-минутного стояния при комнатной температуре (для лучшего образования гидразона пировиноградной кислоты) смесь поме­щают в водяную баню (35 - 37°) на 10 - 15 мин. После охла­ждения производят извлечение 2,4-динитрофенилгидразона пиро­виноградной кислоты с примесью гидразонов некоторых других кетокислот. Для этого к реакционной смеси добавляют 4 млто­луола, смесь тщательно перемешивают воздухом при помощи водоструйного насоса в течение 3 - 5 мин; экстрак­цию можно вести одновременно в нескольких пробирках, соединенных последовательно с водоструйным насосом. После расслоения смеси нижний водный слой, свободный от гидразо­нов, осторожно отсасывают. Если водный слой после экстрак­ции толуолом окрашен, то необходимо повторить экстракцию добавлением 1 - 2 млтолуола. Верхний слой, содержащий из­влеченные гидразоны, подвергают обработке 4 мл10%-ного раствора соды, который избирательно извлекает из толуола 2,4-динитрофенилгидразон пировиноградной кислоты; полная экстракция достигается энергичным перемешиванием смеси вышеуказанным способом. Для полноты извлечения 2,4-динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты рекомендуется производить повторную экстракцию толуоловой смеси 2 млсодового раствора, оба содовых экстракта соединить. После рас­слоения смеси верхний толуоловый слой, уже не содержащий гидразона пировиноградной кислоты, отсасывают, остатки то­луола удаляют фильтровальной бумагой, а в содовом экстракте (нижний слой) определяют количество гидразона пировино­градной кислоты. Для этого к 3 мл(или к 4,5 млв случае по­вторной экстракции) содового экстракта, что соответствуем 0,3 г ткани, прибавляют 3 мл(или 4,5 мл)1,5 н. раствора ед­кого натра (конечная концентрация щелочи должна быть не ме­нее 0,75 н.). При этом развивается красно-бурая окраска, специфичная для 2,4-днннтрофенилгидразона пировиноградной кислоты. По мнению Фридемана и Хаугена, окраску обусловли­вает то, что вторая нитрогруппа 2,4-динитрофенилгидразона на­ходится в параположении. Поскольку в содовом экстракте на­ходится некоторое количество гидразонов кетоглутаровойи щавелевоуксусной кислот, то рекомендуется начинать фотометрирование через 20 мин после прибавления щелочи, так как окраска этих гидразонов нестойка и за что время исчезает.

Фотометрирование производят при светофильтре с длиной волны 465 нм.По величинам экстинкции с помощью калибровочной кривой определяют содержание пировиноградной кислоты в фотометрируемыхпробах. Калибровочную кривую строят на основании данных фотометрирования различных ко­личеств стандартного раствора пирувата натрия, содержащего 20 мкг пировиноградной кислоты в 1 мл раствора.

Калибровочную кривую можно строить также на основании данных фотометрирования различных количеств стандартного раствора 2,4-динитрофенилгидразона пировииоградной кислоты.

Величина экстинкции находится в прямой зависимости от концентрации пировиноградной кислоты. По величинам экстинкции испытуемых проб с помощью калибровочной кривой опре­деляют содержание пировиноградной кислоты в 3 мл(или 4,5 мл) содового экстракта, соответствующего 3 млбезбелкового фильтрата или 0,3 гткани. Расчет количества пировиноградной кислоты производят по уравнению:

где А - количество пировиноградной кислоты (в мг%),

р - количество пировиноградной кислоты (в мкг),соответствующее 0,3 г ткани и определенное по калибровочной кривой.

Лабораторная работа №7