Постановка развёрнутой реакции агглютинации.

Готовят восемь пробирок одинакового диаметра, высоты и конфигурации дна (6 опытных и 2 контрольных). Далее делают последовательные двукратные разведения сыворотки. Сыворотку больного при серодиагностике разводят в соотношении от 1:50 до 1:1600. Иммунную сыворотку при серотипировании разводят до титра или до половины титра (титр указан на этикетке).

Для приготовления исходного разведения сыворотки в разведении 1:50 смешивают 0,1 мл. сыворотки с 4,9 мл. физиологического раствора. Это разведение в количестве 1 мл. вносят в первую, вторую пробирки и в шестую - контроль сыворотки. Далее во вторую и все последующие пробирки (кроме контроля сыворотки) наливают по 1 мл. физиологического раствора. Разведения производят, начиная со второй пробирки. Тщательно перемешав содержимое второй пробирки, из неё отбирают 1 мл. и переносят в третью пробирку. Смешав содержимое третьей пробирки, так же отбирают 1 мл. и переносят в следующую. Так делают разведения во всех опытных пробирках (по шестую включительно). Из шестой пробирки 1 мл. выливают

дезинфицирующий раствор. В каждой опытной пробирке должен содержатся 1 мл. сыворотки в соответствующем разведении. Седьмая пробирка является контролем сыворотки (сыворотка в разведении 1:50), в эту пробирку антиген не вносят. Восьмая пробирка является контролем антигена и содержит 1 мл. физ. раствора, в неё добавляется антиген.

После того, как сделаны соответствующие разведения сыворотки, во все пробирки (кроме контроля сыворотки) вносят по 2 капли (0,1 мл.) антигена - диагностикума (при серодиагностике) или свежеприготовленную взвесь микробов (при серотипировании). При этом в пробирках должна появляться небольшая равномерная муть.

Схема постановки развёрнутой РА.

Ингредиенты в мл.	Пробирки
Опыт	Контроль
						7 сыво­ротки	8 анти­гена
Изотонический раствор NaCl.	-	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-	1,0
		1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Сыворотка 1:50.	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
Полученные разведения.	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:50	-
Диагностикум О или Н.	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-	0,1

Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37° С. Учитывают результат реакции через 18-20 часов для безжгутиковых бактерий (с О-антигеном) и на два часа - для жгутиковых (с Н-антигеном). Для учёта реакции необходимы безукоризненные результаты контролей: равномерное помутнение в контроле антигена и полная прозрачность в контроле сыворотки.

Учитывать результат можно невооруженным глазом, при помощи лупы или в агглютиноскопе.

При положительном результате реакции в пробирках появляются мелкие хлопья склеивающихся клеток, которые оседают на дно пробирки. Жидкость над осадком при этом просветляется. При встряхивании осадка (агглютината) видны хлопья, плавающие в прозрачной жидкости.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию.

Крупнозернистая агглютинация происходит при склеивании подвижных микробов под влиянием жгутиковых Н-антител. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая агглютинация наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается при встряхивании.

Интенсивность реакции агглютинации можно выразить знаком плюс:

++++ все клетки находятся в осадке, жидкость в пробирке совершенно прозрачна - результат резко положительный;

+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости

- результат положительный;

++ осадок ещё меньше и жидкость ещё мутнее - результат слабоположительный;

+ осадок незначительный, жидкость мутная - результат сомнительный; - отсутствие осадка, жидкость равномерно мутная - результат отрицательный.

В случае определения антигена реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. При серодиагностике оценивают динамику нарастания титра антител в парных сыворотках, полученных в начале заболевания и спустя несколько суток.