Полимеразная цепная реакция (Дейвис, 1990)

Для проведения ПЦР готовили необходимое количество реакционной смеси для анализа необходимого числа проб в пропорциях, представленных в таблице 2. Для устранения погрешности, вносимой дозаторами при смешивании микрообъемов, общую смесь готовили из расчета на одну пробу больше, чем необходимо.

Таблица 2

Состав реакционной смеси для проведения ПЦР

Смесь хорошо перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин.

В маркированные пробирки объемом 0.5 мл вносили по 23 мкл полученной реакционной смеси и по 2 мкл ДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Компоненты перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), смесь кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин. Для предотвращения испарения жидкости реакционную смесь покрывали двумя каплями минерального масла. Реакционную смесь инкубировали в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе Fas Hot Start.

Таблица 3

Условия инкубации реакционной смеси в амплификаторе «Терцик»

Таблица 4

Праймеры для выявления полиморфизма Fas -670 (A/G)

Таблица 5

Первичная структура праймеров для амплификации промоторного

участка гена FAS, содержащего олигонуклетидный полиморфизм Fas-670A\G

Результаты реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле.

2.5 Визуализация результатов ПЦР методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1,5% агарозном геле (Maniatis, 1982)

Готовили 1,5%-ный агарозный гель с лунками для внесения проб. Для этого 1,5 г агарозы разводили в 100 мл рабочего трис-ацетатного буферного раствора (24,2 г трис-(гидрокси)аминометана, 5,7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М раствора этилендиаминотетрауксусной кислоты, pH 8.0) и добавляли 10мкл 10%-ного водного раствора бромида этидия. Суспензию нагревали на водяной бане до полного растворения агарозы, периодически помешивая. Раствору давали остыть примерно до 50˚С и заливали в форму для агарозного блока, вставляли гребенку для образования лунок и давали агарозе застыть до состояния геля.

Из-под слоя масла отбирали 10 мкл раствора амплифицированной ДНК и смешивали с 10 мкл буферного раствора для нанесения проб (50% глицерина, 0,25% бромфенолового синего в дистиллированной воде). Полученную смесь переносили в лунки геля. Камеру для электрофореза «Helicon» (г. Москва) подключали к источнику питания «Эльф-2» (Россия), соблюдая полярность. Проводили электрофорез в течение 15 минут при напряжении 200 вольт (краситель должен пройти не менее 2 см геля). Отключали ток. Помещали гель в окно трансиллюминатора «Biokom UVT-1» (Франция). Результат регистрировали с использованием системы видеодокументирования «VITRan».

Прямое определение нуклеотидной последовательности

Для определения нуклеотидной последовательности фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля с последующей элюцией и очищали с использованием набора DNA Extraction Kit («Fermentas», Латвия) согласно рекомендациям производителя. Реакцию терминирования дидезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными флюоресцентными красителями, проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», USA). К 5 мкл ДНК добавляли 1 мкл BigDye Terminator, 2 мкл буфера и 0.5 мкл праймера, инкубировали при 94°С в течение 5 мин и проводили 25 циклов ПЦР по следующей программе: 94°С – 10 сек, 50°С – 10 сек, 62° – 4 мин. Реакционную смесь переосаждали изопропанолом, разводили в 20 мкл деионизованного формамида и прогревали при 94°С в течение 5 мин. Затем проводили анализ нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК с использованием генетического анализатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA).

Результаты и их обсуждение