Определение активности липаз в семенах масличных

И злаковых культур

Липазы относятся к классу ферментов «Гидролазы» (подкласс эстераз) и очень широко распространены в растениях и клетках микроорганизмов. С их участием происходит гидролитический распад ацилглицеринов жира, в связи с чем эти ферменты объединены общим названием – триацилглицерол-липаза (3.1.1.3). В результате действия липаз образуются глицерин и свободные жирные кислоты:

 

СН₂ОСОR₁ CН₂ОН R₁–СООН

| липаза |

СНОСОR₂ + 3Н₂О ¾¾® СНОН + R₂−СООН

| |

СН₂ОСОR₃ CН₂ОН R₃−СООН

 

R₁, R₂ и R₃ – остатки жирных кислот

 

В ходе реакции гидролиза фермент последовательно катализирует расщепление первой сложноэфирной связи триацилглицерина, затем второй и далее третьей.

Большинство липаз находится в клетках растений или микроорганиз-мов в растворимом состоянии и имеют оптимум каталитического действия при рН = 8. Для проявления каталитической активности липаз необходимо присутствие в физиологической среде катионов Са²⁺.

От активности липаз зависит интенсивность мобилизации жиров в листьях и семенах растений для включения образующихся продуктов в обмен веществ, а также способность растительных продуктов к прогорканию, особенно при повышении температуры и влажности во время хранения муки, крупы, растительных масел. У каждого вида растений имеется свой набор липаз, отличающихся растворимостью, оптимумом рН и ионного состава среды. Липазы в значительном количестве содержатся в семенах зерновых и масличных культур, особенно их много в семенах клещевины.

Принцип метода. Определение активности липаз основано на титровании раствором щёлочи свободных жирных кислот, образующихся при взаимодействии с растительным маслом выделенных из растительных источников ферментов. Ферментную реакцию можно также проводить при смешивании с растительным маслом измельчённых семян зерновых и масличных культур.

Оборудование. Фарфоровые ступки с пестиками диаметром 8-10 см; водяная баня; бюретка на 10 мл с трубкой, заполненной натронной известью; конические колбы с пробками на 150 мл; дозирующие пипетки на 1-10 мл; лабораторные весы; мерные колбы на 500 и 1000 мл; капельница для индикаторного раствора; марля для фильтрования; фарфоровые чашки диаметром 6-8 см.

Реактивы. Дигидрофосфат калия; гидрофосфат натрия; дистиллиро-ванная вода (свободная от диоксида углерода); гидроксид калия; 1% спиртовой раствор фенолфталеина.

Приготовление растворов. 1/15 М фосфатный буфер (рН=7,4): 11,866 г Na₂HPO₄∙2Н₂О растворяют в 1 л дистиллированной воды; 4,537 г KH₂PO₄ растворяют в 500 мл дистиллированной воды; затем 182 мл раствора дигидрофосфата калия смешивают с 818 мл раствора гидрофосфата натрия.

0,05 М раствор КОН: 2,806 г КОН помещают в фарфоровый стакан и растворяют в 300 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор количественно переносят в мерную колбу на 1 л, объём раствора в колбе доводят водой до метки, содержимое колбы тщательно перемешивают и определяют точный титр полученного раствора.

1% раствор фенолфталеина: 1 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 50% этилового спирта.

Ход определения. В фарфоровую ступку помещают 2 г сухих или 3 г прорастающих семян и растирают пестиком с небольшим количеством квар-цевого песка до получения однородной массы. Затем в ступку приливают 20 мл фосфатного буферного раствора (рН=7,4) и смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. После этого суспендированную смесь переносят на марлю, уложенную в 4 слоя в фарфоровой чашку, и отжимают ферментный экстракт в чашку. Дозирующей пипеткой отбирают 2 пробы ферментного экстракта по 5 мл и помещают их в конические колбы, одну из которых ставят на 10 минут в кипящую водяную баню для инактивации ферментов.

После охлаждения нагретой колбы в обе колбы (с активными и инактивированными ферментами) приливают пипеткой объём растительного масла, имеющий массу 3 ± 0,01 г, полученную смесь перемешивают и колбы ставят на 30 минут в термостат при температуре 30°С, при этом фиксируют точное время начала ферментативной реакции. По истечении 30 минут смеси в колбах титруют с 3 каплями раствора фенолфталеина водным 0,05 М раствором КОН.

Обработка и оценка результатов. Активность липаз вычисляют по формуле:

(V₂ - V₁) ∙ K ∙ 2,8

А = ¾¾¾¾¾¾¾¾,

Н ∙ t

 

где А – активность липаз в мг гидроксида калия, затраченного на титрование образующихся за 1 час при гидролизе жира кислот, в расчёте на 1 г растительной массы;

V₁ – объём 0,05 М раствора гидроксида калия, затраченный на титрование образующихся под действием липаз жирных кислот, мл;

V₂ – объём 0,05 М раствора гидроксида калия, затраченный на титрова-ние аналитической пробы с инактивированными ферментами, мл;

К – поправка к титру 0,05 М раствора гидроксида калия;

Н – навеска растительного материала, г;

2,8 – количество гидроксида калия в 1 мл 0,05 М раствора КОН, мг;

t – время ферментативной реакции в часах.

Полученный показатель активности липаз в конкретной растительной пробе сравнивают с другими данными, характеризующими уровень актив-ности липаз в семенах различных зерновых и масличных культур, а также изменение активности липаз в процессе прорастания семян. На основе полученного результата оценивают качество семян масличных культур и возможность их длительного хранения.

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют липазы?

2. Каковы особенности ферментных белков липаз?

3. Как влияют липазы на качество растительной продукции?

4. Под воздействием каких факторов повышается активность липаз?

5. Какой принцип положен в основу определения активности липаз?

6. Как получают ферментный экстракт липаз?

7. В чём состоят особенности проведения ферментной реакции и титрова-ния образующихся под действием липаз жирных кислот раствором КОН?

8. Каковы принципы расчёта активности липаз?

9. Как изменяется активность липаз при прорастании семян зерновых и масличных культур?