Обнаружение внутриклеточных включений

При многих вирусных заболеваниях в клетках (в цитоплазме или ядре) различных органов и тканей появляются особые образования, называемые тельцами-включениями. Их классифицируют по локализации в клетке, составу нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности. Вирусные тельца-включения хорошо обнаруживаются в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для этого фиксированные на покровных стеклах клетки промывают в дистиллированной воде и погружают на 5–15 мин в раствор гематоксилина (гематоксилин Майера, Эрлиха, Карацци и др.).

Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции

В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.

Обнаружение вирусов с помощью иммунопероксидазной реакции (иммуноферментного анализа)

Методика изложена в специальном разделе.

Обнаружение вирусов с помощью электронного микроскопа

Методика изложена в специальном разделе.

Метод, основанный на интерференции вирусов

Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни – вируса везикулярного стоматита и т. д.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1. Методы индикации вирусов в зараженных клеточных культурах.

2. ЦПД, классификация.

3. Технику заражения клеточных культур.

4. Индикацию вирусов методом бляшек.

5. Сущность реакции гемадсорбции.

 

ТЕМА 13. ТИТРОВАНИЕ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ В РЕАКЦИИ ТОРМОЖЕНИЯ (ЗАДЕРЖКИ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА, РЗГА)

Цель занятия

Ознакомление с методикой постановки реакции торможения (задержки) гемагглютинации.

Оборудование и материалы

Вирус ньюкаслской болезни с известным титром (от предыдущего занятия), сыворотка крови кролика, иммунизированного вирусом ньюкаслской болезни, обработанная СО₂, физиологический раствор NaCl, 1%-ная суспензия отмытых эритроцитов петуха; плексигласовые панели с лунками, пипетки градуированные на 1 мл, резиновые груши; аппарат Кипа, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя

ПРИНЦИПЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Антителами называются белки, образующиеся в организме теплокровного животного в ответ на парентеральное введение высокомолекулярных веществ с признаками генетической чужеродности для данного организма. Вещества, на введение которых образуются антитела, называются антигенами. Вирусы в подавляющем большинстве являются антигенами. Антитела способны вступать во взаимодействие с тем антигеном, в ответ на который они образовались (специфичность антител), и нейтрализовать его биологическую активность. Таким образом антитела защищают организм от инфекционных агентов, и в этом состоит биологический смысл их образования.

Антитела могут взаимодействовать с гомологичными антигенами не только m vivo, но и in vitro.

Обычно источником антител служит сыворотка крови (serum), и поэтому реакции взаимодействия антител с антигенами in vitro называются серологическими. Одной из простейших серологических реакций является реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РТЗА). Она основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.

ПРИНЦИП РТГА

 

Состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях. Поэтому, для того чтобы определенное количество вируса было лишено гемагглютинирующей способности, требуется определенный минимум антител, а так как один из компонентов РТГА всегда неизвестен, приходится реакцию ставить в ряду пробирок с различными дозами антител и одинаковыми дозами вируса или наоборот. Это достигается тем, что берут или разные разведения сыворотки и одно и то же разведение вируса, или разные разведения вируса и одно и то же разведение сыворотки.

РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток: РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГ А состоит в следующем:

– готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл);

– к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

– смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса ньюкаслской болезни 40–60 мин при комнатной температуре);

– ко всем смесям добавляют равные объемы 1%-ной суспензии отмытых эритроцитов;

– после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Задания

Определить в РТГА титр антител к вирусу ньюкаслской болезни в сыворотке крови кролика.

Самостоятельная работа студентов

По схеме постановки РТГА: а) получение 2-кратных разведений сыворотки (по 0,2 мл); б) добавление вируса в титре 4 ГАЕ (по 0,2 мл); в) контакт вируса с сывороткой 40–60 мин. в) розлив суспензии эритроцитов; б) экспозиция (30–40 мин); г) Учет и запись результатов титрования антител в РТГА.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1.Что такое антигены и антитела?

2.Что такое серологические реакции и для чего они используются?

3.В чем принцип и использование РТГА?

4.Что вы знаете о модификации РТГА?