Результаты выявления U. urealyticum у пациентов с циститом и определение их биоваропринадлежности.

Определение наличия U. urealyticum и биоваров проводилось с помощью ПЦР, после первичного выделения клинического изолята в жидкой питательной среде как описано в главе материалы и методы.

Всего в нашем исследованиии было проанализированно 62 клинических изолята с воспалительными процессами, локализованными на стенке мочевого пузыря, подтвержденными эндоскопическими и лабораторными методами диагностики. В обследованной группе больных у 36 человек была выявлена U. urealyticum, что составило 58%. Выявленные клинические изоляты в основном принадлежали к биовару Parvo (30 изолятов- 83,3%), 5 изолятов принадлежали к биовару Т-960 -(13,9%) а в одном изоляте были обнаружены уреаплазмы обоих биоваров (2,8%) (рис 7).

Рис 7. Соотношение проанализированных клинических изолятов по биоварам.

Для проверки работы трех-праймерной системы (см материалы и методы), позволяющей дифференцировать биовары в ходе ПЦР, мы разделяли геномную ДНК, выделенную из клинических изолятов уреаплазм с помощью электрофореза в переменном электрическом поле (ПЭФ). Как известно из литературных данных, геном уреаплазм, принадлежащих к биовару Parvo меньше генома биовара Т-960 в 1.5-2 раза и составляет ~700 т.п.о, поэтому использование пульс-электрофореза являлось хотя и трудоемкой, но надежной процедурой определения биовара у выделенных нами клинических изолятов. Условия разделения описаны в главе материалы и методы. В предварительных экспериментах было продемонстрировано полное совпадение результатов полученных с использованием ПЦР и пульсэлектрофореза (рис 8,9).

Рисунок 8.

Пульс-электрофорез геномной ДНК изолятов Ureaplasma urealyticum, относящихся к биоварам T960 (1,2) и Parvo (3,4).

Рисунок 9.

Электрофорез продуктов амплификации, полученных в результате трех-праймерной ПЦР с ДНК изолятов, относящихся к биоварам Parvo (1,2) и T960 (3,4). М- маркер молекулярных масс "Fermentas".

На следующем этапе исследования мы применили методику определения биоваров для анализа клинических образцов без дополнительного выделения клинических изолятов уреаплазм на селективной питательной среде. На рис 10 представлены результаты по сравнению работы предложенного метода с ДНК U.urealiticuym и суммарной ДНК, выделенной из соскобов эпителия урогенитального тракта:

Рисунок 10.

Электрофорез продуктов амплификации ДНК, выделенной из клинических изолятов, выросших на селективной питательной среде (1-7), и ДНК, выделенной из соскобов эпителия урогенитального тракта (9-15).

Проведенные исследования позволили нам заключить, что метод определения принадлежности к биоварам может быть использован и для клинического анализа без стадии микробиологического культивирования уреаплазм. В этом случае необходимо отметить некоторое снижение чувствительности амплификации по сравнению с тестом на определение уреаплазм с использованием праймеров на фрагменты гена уреазы или гена 16S рРНК. Вместе с тем, увеличение количества циклов компенсирует эту проблему и в компаративных исследованиях нам удалось добиться 98%-ой сходимости результатов.

Полученные данные позволяют сделать выводы о высоком проценте присутствия U. urealyticum у пациентов с циститом, о преимущественной принадлежности U. urealyticum у больных циститом к биовару Parvo и о низкой величине присутствия у больных циститом сразу обоих биоваров.