Проведение процесса высаливания

Самая сложная стадия процесса высаливания – это внесение соли и способ ее растворения. Соль измельчают и медленно добавляют небольшими порциями при постоянном перемешивании, чтобы избежать локальных зон повышения концентрации соли в растворе. При перемешивании может наблюдаться вспенивание раствора, которое нежелательно, так как при попадании фермента в пузырьки пены он может денатурироваться в результате воздействия поверхностного нятяжения. Поэтому перемешивание должно быть умеренным, без пенообразования. После введения последней порции соли перемешивание следует продолжать еще 20-40 мин до достижения полного равновесия между растворенными и агрегированными белками. Образование осадка начинается со слабого помутнения, которое постепенно переходит в суспензию со взвешенными хлопьями. Процесс формирования осадка зависит от температуры, объема обрабатываемой жидкости, рН среды и может длиться от 20-40 мин до нескольких часов. Повышение температуры при высаливании благоприятствует быстрому агрегированию молекул белка в крупные хлопья, поэтому процесс ведут при 20-30˚С.

В целом высаливание – очень сложный технологический процесс, зависящий от множества факторов, особенно в заводских условиях. Кроме того, важно помнить, что соль никогда не осаждает фермент полностью, а только снижет его растворимость. Например, если содержание высаливаемого фермента в исходном растворе составляет 1 мг/мл и в результате добавления соли растворимость его понижается в 10 раз (до 0,1 мг/мл), это значит, что 90% фермента выпало в осадок при высаливании. Однако, если исходная концентрация фермента 0,1 мг/мл, то при том же содержании соли в растворе осаждения фермента не будет.

Осадки, полученные при высаливании при соблюдении нужных условий, имеют однородную структуру, содержат меньше органических балластных веществ; их легко сушить, измельчать, они слабо окрашены и хорошо растворяются. Если удалить их этих препаратов соль путем диализа или последующего растворения и осаждения органическим растворителем, то в лабораторных и даже промышленных условиях можно получать сравнительно чистые ферментные препараты с минимальными потерями.

ОСАЖДЕНИЕ ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

Ионы тяжелых металлов также довольно широко применяются для осаждения и фракционировния различных белков, в частности ферментов. Для этих целей могут использоваться соли свинца, ртути, цинка, железа и реже — меди и урана. Кальций и барий также являются специфическими осадителями некоторых белков.

Ионы металлов редко применяют как единственный способ очистки, а чаще в сочетании с другими методами, такими как фракционирование при помощи солей и спиртов. Иногда тяжелые металлы используют для осаждения балластных белков из ферментного препарата; это можно делать только тогда, когда доказано специфическое сродство металла к определенным реакционноспособным группам некоторых типов белковых молекул. Благодаря такой специфичности металлы, подобранные соответствующим образом, можно использовать также для улучшения кристаллизации ферментов из смеси или для их дробного осждения.

Основным недостатком ионов тяжелых металлов является то, что, как и органические растворители, они обладают способностью интенсивно денатурировать белки. Однако тщательное регулирование температуры и рН значительно снижет вероятность необратимой денатурации (инактивирования) ферментов: ртуть, например, которая в высшей степени ядовита для большинства ферментных систем из-за своей способности реагировать с сульфогидрильными группами, может осаждать ферменты (энолазу) практически не денатурируя их, и облегчать кристаллизацию.

Отделить атомы металлов от белков можно различными способами; цинк, например, удаляли диализом белковых растворов против растворов глицина, этилендиамино-тетрауксусной (ЭДТА), лимонной кислоты или снижением рН смеси, или с помощью катиообменных смол.[4]

ПРИМЕР ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИХ ДРОЖЖЕЙ

При выделении белков часто сочетают несколько методов осаждения. Выделение дегидрогеназы начинают с экстракции фермента буферным раствором. За этим следует умеренное нагревание для осаждения белков и других компонентов смеси, легче подвергающихся денатурации, чем выделяемая дегидрогеназа. Большую часть фермента (а также другие вещества с близкой растворимостью) осаждают ацетоном; при этом отделяются многие низкомолекулярные соединения, экстрагирующиеся вместе с белком. Последующее растворение и повторное осаждение сульфатом аммония приводят к получению препарата с большей удельной ферментативной активностью. Такой способ очистки, однако, сопровождается потерей некоторого количества фермента на каждой операции (см таблицу 1)

Дальнейшую очистку для отделения дегидрогеназы от других белков с близкой растворимостью выполняют путем последовательного суспендирования осадка во все менее и менее концентрированных растворах сульфата аммония. Поскольку растворимость белков возрастает при снижении концентрации соли до величин, значительно уступающих концентрации насыщенного раствора, то таким путем удается очистить фермент от все более и более близких белков. Полученная в результате ряда таких операций супернатантная жидкость имеет удельную активность (ферментативную активность, отнесенную к общему количеству растворенных белков), которая примерно в 100 раз превышает удельную активность исходного продукта экстракции буферным раствором. Кроме того в этих операциях отделяется большая часть примесей небелковой природы.[3]

Таблица 1

Выделение алкогольдегидрогеназы из сухих пекарских дрожжей