Рестрикционный анализ (restriction analysis)

Рестрикционный анализ (restriction analysis) [лат. restrictio — ограничение; греч. analysis — разложение, расчленение] — установление мест расщепления одной или несколькими рестриктазами конкретной нуклеотидной последовательности ДНК.

При проведении целенаправленного поиска конкретных точковых мутаций важная роль принадлежит использованию рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) - особых клеточных ферментов, выделяемых из различных штаммов бактерий. Ценным свойством рестрикционных эндонуклеаз является распознавание ими специфических нуклеотидных последовательностей длиной от 4 до 10 нуклеотидов, в результате чего фермент осуществляет рестрикцию, т.е. разрезапие этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК.

Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность - сайт рестрикции (сайт узнавания). В настоящее время известно уже несколько сотен различных рестриктаз и, следовательно, столько же различных вариантов коротких нуклеотидных последовательностей, образующих сайты рестрикции. В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный фрагмент ДНК; в некоторых случаях, напротив, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме. В обеих описанных ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе.

Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой-либо определенной точковой мутации задача сводится к компьютерному поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности; обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели.

Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

  Метод риботипирования позволяет существенно уменьшить количество анализируемых фрагментов ДНК. Он направлен на выявление у изучаемых штаммов различий в количестве рибосомальных оперонов, а также рестрикционного полиморфизма их нуклеотидных последовательностей. Для этого продукты гидролиза ДНК разделяются методом электрофореза в агарозном геле, а затем гибридизуются с ДНК зондами на один или несколько генов, кодирующих 16S, 23S, 5S рибосомальные РНК. Данный метод может применяться как для установления видовой принадлежности изолятов, так и для их внутривидовой классификации. Он позволяет дифференцировать близкородственные и сходные по свойствам виды стрептококков, а также идентифицировать их новые подвиды. Часто, в случае неэффективности анализа рестрикционного профиля ДНК, риботипирование позволяет различить штаммы одного и того же серотипа в пределах вида [11, 28].

При сравнительном анализе "парных" изолятов СГВ, выделенных из молока матери и у новорожденного, показано, что они были идентичны как по серотипу, так и по риботипу. Это явилось одним из первых генетических доказательств возможности заражения ребенка через материнское молоко [5].

Однако до сих пор риботипирование как метод идентификации СГВ применяется редко, а результаты, полученные различными исследователями, оказываются противоречивыми. Причина этого кроется в использовании различных ферментов для гидролиза ДНК и различных генов pРНК в качестве зондов [5, 11, 26, 28].

Выбор фермента является, пожалуй, основным критерием для оценки результатов риботипирования. Например, обнаружено, что наибольшей "разделяющей способностью" (index of discrimination - ID) обладает фермент Pstl. Среди 111 эпидемиологически не связанных изолятов СГВ было выявлено 35 Pstl риботипов, при этом более половины культур принадлежало лишь к 7 из них [26]. Это позволило предположить, что риботипирование имеет все же ограниченное значение для эпидемиологических исследований. Поскольку взаимосвязь между риботипом и серотипом штаммов четко не прослеживалась, для расширенной характеристики штаммов рекомендовано использовать оба этих подхода [26, 28].

Позднее комплексный анализ 114 штаммов выявил, что они могут быть сгруппированы в 5 генетических кластеров. Эти результаты совпадают с данными о существовании различных генетических субпопуляций СГВ [13, 15, 25, 35]. Критерием для отнесения штаммов СГВ к одному кластеру явились идентичность или значительное сходство их рибосомальных типов. Для части штаммов СГВ была обнаружена корреляция между серотипами и риботипами. При этом большинство штаммов серотипа Iа оказалось в одном кластере, а большинство штаммов серотипа Ib - в другом. Штаммы серотипа III по результатам риботипирования оказались в различных кластерах, однако 95% высоковирулентных инвазивных штаммов серотипа III, выделенных из спинномозговой жидкости новорожденных, принадлежали к одному кластеру и были, по-видимому, генетически однородными. Для дифференцировки этих штаммов оптимальным оказалось использование 3 ферментов для риботипирования - HindIII, Pstl, CfoI [7].

По другим данным, оптимальным среди 24 рестриктаз оказался фермент HhaI. Аналогичные результаты получены другими исследователями, которые показали эффективность совместного использования серотипирования, а также HhaI и HindIII риботипирования для эпидемиологии инфекций, вызываемых СГВ [28]. Интересно, что при изучении культур от человека и животных выявлен ряд штаммов с идентичными риботипами, что должно свидетельствовать об обмене СГВ между человеком и животным или, по крайней мере, о генетическом родстве этих штаммов [28].