Основные шаги в тесте ИФА на присутствие антигена

 

Шаг 1: Добавить ваши образцы и контроли в лунки плашки. Ваши образцы содержат много разных белков и могут содержать или не содержать антиген. Подождите 5 минут, чтобы дать возможность всем белкам за счет гидрофобных взаимодействий связаться со пластиком плашки.

 

 

Шаг 2: добавить в лунку антитела против антигена – первичные антитела. Если в вашем образце присутствовал антиген, первичные антитела найдут его молекулы среди всех других молекул, и прочно свяжутся с ними.

 

Шаг 3: добавить соединенные с ферментом – пероксидазой вторичные антитела (антитела на антитела). Если в образце есть первичные антитела, связанные с антигеном, вторичные антитела свяжутся с ними.

 

Шаг 4: добавить субстрат пероксидазы, подождать 5 минут, и оценить результаты анализа. Если раствор в лунке станет синим, анализ положительный (в вашем образце присутствует исследуемый антиген). Если раствор останется бесцветным, анализ отрицательный.

 

 

Вопросы до лабораторной работы

Как иммунная система защищает нас от болезней?

 

Как доктора используют наш иммунный ответ, чтобы защитить нас от болезней?

Как вырабатываются антитела в вашем организме?

Как производятся антитела для ИФА?

Почему важна быстрая диагностика заболеваний?

 

Как расшифровывается ИФА?

 

Зачем в этом тесте используются ферменты?

 

Почему в тесте наряду с опытными образцами нужен положительный и отрицательный контроль?

 

 

Лабораторный протокол

 

 

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

 

Предмет	Содержимое	Количество	(ü)
Желтые пробирки	Образцы для анализа (0.75 мл)	4 шт (по 1 на ученика)	q
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	q
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	q
Зеленая пробирка (П.А.)	Первичные антитела (1.5 мл)	1 шт	q
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5.мл)	1 шт	q
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	q
12-луночные стрипы		2 шт	q
Микропипетка		1 шт	q
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	q
Одноразовые пластиковые пипетки		1 шт	q
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	q
Большая пачка бумажных полотенец		2	q
Черный фломастер (маркер)		1 шт	q

 

 

Выполнение ИФА

 

1. Подпишите желтую микроцентрифужную пробирку вашими инициалами (именем). Возьмите ваш 12-луночный стрип. Подпишите первые три лунки «+» (это будет положительный контроль), следующие три лунки «-» (отрицательный контроль). Следующие шесть лунок предназначаются для вашего опыта и опыта вашего напарника по работе (по три), подпишите их вашими инициалами. Например, Митя Гиляров и Аня Лопатина подписали бы свои лунки так:

 

1. Для связывания антигена:

 

а. Чистым носиком перенесите по 50 мкл положительного контроля из фиолетовой пробирки в первые три («+») лунки.

 

б. Чистым носиком перенесите по 50 мкл отрицательного контроля из синей пробирки в следующие три («-») лунки.

 

в. Вместе с вашим напарником перенесите по 50 мкл ваших образцов в подписанные вашими именами лунки. Обязательно используйте чистый носик для каждого образца!

 

1. Подождите 5 минут, для того чтобы все белки в составе образца связались с плашкой.

 

1. Промойте лунки:

 

А. Переверните стрип, положите его на пачку бумажных полотенец и легонько постучите по дну. Убедитесь, что брызги не попали обратно в лунки.

 

 

Б. Выкиньте верхнее полотенце.

 

В. Чистой пипеткой заполните каждую лунку буфером для промывки из стакана, стараясь не переливать его через стенки. Для всех стадий промывки можно использовать одну и ту же одноразовую пипетку.

 

Г. Опять положите стрип на пачку полотенец и постучите по дну.

 

 

 

Д. Выкиньте 2-3 верхних полотенца (которые промокли).

 

 

1. Повторите всю процедуру промывки (шаг 7) еще раз.

 

 

1.   Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора первичных антител («П.А».)из зеленой микропробирки во все 12 лунок.

 

 

 

1. Подождите 5 минут, чтобы антитела могли связаться с антигеном

 

1. Промойте лунки, повторив процедуру промывки ДВА раза.

 

 

1. Чистым носиком добавьте по 50 мкл раствора вторичных антител («В.А.») из оранжевой пробирки во все 12 лунок.

 

1. Подождите 5 минут, чтобы вторичные антитела могли связаться с первичными.

 

 

1. Промойте лунки, повторив процедуру промывки ТРИ раза.

 

1. Чистым носиком добавьте по 50 мкл субстрата пероксидазы («Субстрат») из коричневой пробирки во все 12 лунок.

 

 

 

1. Подождите 5 минут. Наблюдайте за тем, что получилось, и запишите ваши результаты.

 

Результаты

 

Обозначьте лунки на картинке так же, как лунки в вашем эксперименте и напишите «+» на тех лунках, которые стали синими и «-» - на тех, которые остались бесцветными.

 

Результат вашего анализа положительный или отрицательный? Объясните ваш ответ.

 

 

Вопросы к лабораторной работе