Влияние температуры и рН на активность ферментов

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях: температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом, скорость катализируемой реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Механизм биохимической ферментативной реакции можно представить упрощенно в общем виде:

                                                       (4)

,                                                                              (5)

 где Е – фермент;

S – субстрат;

ES – фермент-субстратный комплекс;

Р – продукт реакции;

k₊₁, k_–1, k₂ – константы скоростей прямых и обратных реакций.

Константа Михаэлиса – Ментен (К_m) характеризует константу диссоциации фермент–субстратного комплекса и численно равна концентрации субстрата (в моль/л), при которой скорость данной реакции составляет 1/2 от максимальной. Она характерна для каждой пары фермент–субстратного комплекса.

Уравнение Михаэлиса – Ментен выражает зависимость скорости биохимической

ферментативной реакции от концентрации субстрата:

 ,                                                          (6)

где V – скорость данной биохимической реакции;

V_max– максимальная скорость реакции;

[S] – концентрация субстрата;

К_m – константа Михаэлиса – Ментен.

Если концентрация субстрата в реакции низка, т.е. [S]<<К_m, то уравнение приобретает вид:

                                                      (7)

т.е. при низких концентрациях субстрата скорость биохимической реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата и описывается уравнением I-го порядка.

При высоких концентрациях субстрата, т.е. [S] >> К_m, величиной К можно пренебречь, тогда

                                                (8)

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость биохимической реакции становится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка (рисунок 1).

V

 

n = 0

 

n = 1

 

 

[S]

участок кривой при n = 0 – уравнение реакции 0-го порядка;

участок кривой при n = 1 – уравнение реакции 1-го порядка.

Рисунок 2 – График зависимости скорости биохимической реакции (V) от концентрации субстрата [S]

Любые воздействия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств.

Термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов.

Температурный оптимум действия большинства ферментов животного происхождения составляет 37–50 °С, а растительных 40–60 °С. При нагревании свыше оптимальной температуры активность ферментов снижается и при 80 °С большинство ферментов инактивируется вследствие денатурации. При низких температурах (0 °С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает.

Ферменты чувствительны к рН среды. Концентрация водородных ионов действует на активный центр ферментов, на степень его ионизации, а также на ионизацию субстрата и, следовательно, на формирование фермент–субстратного комплекса и скорость реакции. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН. Незначительное отклонение рН от оптимального значения замедляет или прекращает действие ферментов.

Оптимальное значение рН для пепсина – 1,5–2,0; амилазы слюны – 6,8–7,0; амилазы солода – 4,4–4,5; липазы поджелудочной железы – 7,0–7,8.

Как видно из приведенных примеров, ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из разных объектов, могут иметь разный оптимум действия рН.

Принцип метода. Заключается в различной окраске раствора крахмала йодом, зависящей от степени его гидролиза амилазой при различных значениях температуры и рН среды.

Ход работы. Налить в 5 пробирок по 5 мл 0,1 %–ного раствора крахмала. В первые четыре налить по 1 мл дистиллированной воды, а в пятую – 1 мл 0,1 н. НСI. Первую пробирку ставят в лед или снег, вторую оставляют при комнатной температуре, третью и пятую помещают в термостат при 40°С, а четвертую ставят в кипящую баню на 10–15 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют еще на 10–15 мин в тех же условиях. Нагретые пробирки охлаждают и во все добавляют 1–2 капли раствора Люголя. Отмечают окраску всех пробирок и делают вывод о действии температуры и рН на активность фермента.