Заражение культивируемых клеток сыворотками от пациентов, инфицированных ВГС

Инфицированная HCV сыворотка пациента (минимум 10 ⁴ эквивалентов генома / мл) была отфильтрована через фильтры 0,45 мкм (Fisher Scientific) и заморожена в аликвотах по 1 мл при -70 ° C. Свежий флакон с замороженной сывороткой использовали для каждого нового эксперимента по передаче. Клетки инфицировали, используя 500 мкл талой донорской сыворотки [ 10, 11 ].

Генерация макрофагов

Макрофаги генерировали из мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (CBMCs) путем обработки форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA, 5 нг / мл в полной среде) [ 12]. Большинство клеток, прилипших к пластику, были положительными на неспецифическую эстеразу и фагоцитоз, которые являются установленными маркерами для всех макрофагов. Во всех случаях были приготовлены несколько колб (Falcon 3108 и 3109) для отдельного использования либо для заражения сыворотками HCV, либо для совместного культивирования с мононуклеарными клетками периферической крови инфицированного пациента (РВМС). Неадгезивные клетки содержали приблизительно 60% CD19 и CD20-позитивных B-клеток, причем остальную часть составляли T-клетки и моноциты. Клетки, которые не окрашивались в отношении макрофаг-специфических маркеров или фагоцитоза, были обозначены как недеформированные лимфоидные клетки, а затем инфицированы либо HCV с использованием 500 мкл сыворотки, либо совместно культивированы с PBMC от того же пациента.

Заражение макрофагов ВГС

Макрофаги сначала обрабатывали полибреном (5 нг / мл) в течение ночи, а затем инфицировали либо 500 мкл сывороток, либо совместно культивировали с РВМС от того же пациента (фиг. 1А). Эти инфицированные макрофаги инкубировали в течение ночи при 37 ° С в атмосфере с 5% СО ₂. Среды были изменены, и культуры были продолжены в течение еще шести дней со сменой среды на четвертый день.

Фигура 1

Выделение ВГС от людей. (A) Схема выделения для репликации HCV in vitro. (Б) История передачи образца, пожертвованного от инфицированного ВГС пациента № 081. Свежие макрофаги инфицировали с использованием бесклеточной сыворотки или совместно культивировали с инфицированным HCV PBMC из крови пациента # 081. Т-клетки человека (112 А), В-клетки (112 В) или неосвоенные лимфоидные клетки (112 АБ) затем были инфицированы бесклеточной передачей ВГС из супернатанта клеточной культуры из макрофагов или совместно культивированы с макрофагами, инфицированными ВГС., Точно так же недавно трансформированные В-клетки пуповинной крови (PCLB 1 °) были инфицированы бесклеточной передачей из ранее инфицированного супернатанта культуры В-клеток (112 B). Неинфицированные трансформированные В-клетки (PCLB T1-T4) инфицировали последовательной бесклеточной передачей из отфильтрованного культурального супернатанта PCLB 1 °. Клетки-предшественники нейронов были инфицированы бесклеточной передачей HCV из отфильтрованного культурального супернатанта # 081.

Изображение в полном размере

Генерация иммортализованных В-клеток

Для создания иммортализованных В-клеток мононуклеарные клетки пуповинной крови (CBMC) стимулировали митогеном (PWM, 5 мкг / мл в полной культуральной среде), а затем инфицировали трансформирующим вирусом Эпштейна-Барра (EBV). Эти иммортализованные B-клетки не продуцировали EBV [ 13, 14 ].

Приготовление супернатантов клеточных культур

Среды, взятые из культур зараженных макрофагов, центрифугировали при 500 × g в течение 10 минут. Супернатанты затем фильтровали через фильтр 0,45 мкм для удаления постороннего материала. Отфильтрованный супернатант называют супернатантом клеточной культуры.

Бесклеточная передача ВГС

Клетки-мишени предварительно обрабатывали в течение ночи полибреном (5 нг / мл). Аликвоту 500 мкл супернатанта клеточной культуры использовали для заражения каждой из клеток-мишеней.

Дизайн положительных и отрицательных нитей праймеров

Для идентификации HCV-RNA вложенные праймеры для каждой цепи из 5'-нетранслируемой области (UTR) были разработаны CIMM с использованием параметров по умолчанию программы DNASTAR PrimerSelect (таблица 1).

Таблица 1 Праймеры, используемые для анализа ВГС

Таблица в натуральную величину