Методы изучения антибиотикочувствительности

Метод бумажных дисков

Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта. При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала лечения антибиотиками, т. к. под их воздействием рост микроорганизмов может быть полностью угнетен. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведений в жидких и плотных питательных средах.

Метод бумажных дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри.

На засеянную поверхность на одинаковом расстоянии друг от друга пинцетом помещают бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посев инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов.

Оценка результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методами дисков и серийных разведений

Антибиотик	Метод дисков: диаметры зон задержки роста на среде АГВ (агар Гурьева-Васильева)	Метод серийных разведений: минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл
Устойчивые   (R)	Умеренно устойчивые (I)	Чувстви- тельные (S)	Устойчивые	Чувстви- тельные
Бензилпенициллин	≤ 20	21-28	≥ 29	-	≤ 0.1
Ампициллин	≤ 20	21-28	≥ 29	-	≤ 0.2
Карбенициллин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 32	≤ 16
Метициллин	≤ 13	14-18	≥ 19	-	≤ 3
Оксациллин	≤ 15	16-19	≥ 20	-	≤ 3
Цефалексин	-	-	-	≥ 32	≤ 10
Цефалотин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 32	≤ 10
Стрептомицин	≤ 16	17-19	≥ 20	≥ 15	≤ 6
Неомицин	≤ 12	13-16	≥ 17	-	≤ 10
Канамицин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 25	≤ 6
Мономицин	≤ 13	14-17	≥ 18	-	≤ 10
Гентамицин	≤15		≥ 16	≥ 6	≤ 4
Тетрациклин	≤ 16	17-20	≥ 22	≥ 12	≤ 2
Эритромицин	≤ 17	18-21	≥ 22	≥ 8	≤ 2
Линкомицин	≤ 19	20-23	≥ 24	≥ 8	≤ 2
Левомицетин	≤ 15	16-18	≥ 19	≥ 16	≤ 8
Рифампицин	≤ 12	13-15	≥ 16	≥ 8	≤ 2
Полимиксин	≤ 11	12-14	≥ 15	≥ 50 Ед/мл	-
Ристомицин	≤ 9	10-11	≥ 12	-	≤ 5

 

Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений.

Метод серийных разведений

Данным методом определяют минимальную ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий концентрацию антибиотика (МИК). Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶-10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры).

Номер пробирки	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика, мкг/мл	Исследуемая культура, мл	Рост бактерий (помутнение среды)
	1:100		0,1	-
	1:200		0,1	-
	1:400		0,1	-
	1:800	12,5	0,1	-
	1:1600	6,25	0,1	+
	1:3200	3,12	0,1	+
	1 мл бульона без антибиотика	0,1	+ (контроль)

Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации а/б.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

 

Схема описания антибиотиков

Название препарата ………………….

Классификационное положение: антибиотик (класс препарата)

Действующее начало: антибиотик (механизм действия на микробную клетку)

Получение: путем биосинтеза

полусинтетические

путем химического синтеза

Применение: 1) лечение инфекций;

2) определение чувствительности бактерий к антибиотику

Способ применения: 1) перорально, парентерально, местно;

2) in vitro, метод «бумажных дисков»

К работе № 3