Полимеразная цепная реакция, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.

Полимеразная цепная реакция -- это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10⁸ раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР: высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных патогенов. Поскольку в результате цепной амплификации образуются идентичные фрагменты специфичной ДНК, сразу же может быть осуществлено клонирование или секвенирование продуктов реакции. Матрицей для ПЦР-амплификации могут служить как геномная ДНК, так и кДНК, синтезированная путем обратной транскрипции РНК- Чувствительность метода позволяет обнаружить и амплифицировать единственную молекулу ДНК- При автоматизации ПЦР и наличии нерадиоактивных материалов для мечения ДНК полнмеразная цепная реакция обещает стать в будущем стандартной молекулярно-биологической процедурой. Можно предположить, что велика будет и ее роль в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний.

ПЦР в лабораторной диагностике инфекций характеризуется быстро­той, непревзойдённой чувствитель­ностью и высокой специфич­ностью, что позволяет обнаружи­вать микроорганизмы, присутству­ющие в очень низких концентраци­ях (1-10 возбудителей в пробе). При этом ДНК инфекционных аген­тов может быть достаточно эффек­тивно экстрагирована из любой биологической жидкости или тка­ни, а также из проб объектов окру­жающей среды (почвы, воды и т.д.) и продуктов питания. Полимераз­ная цепная реакция эффективна при обнаружении бактериальных, грибковых, паразитарных и вирус­ных патогенов.

Одним словом, это метод, осно­ванный на принципе амплифика­ции, — изолированного умножения гена или его определённого фраг­мента. Амплификация — один из способов выживания микроорга­низмов и клеток животных в усло­виях действия противоопухолевых и противобактериальных препара­тов. ПЦР позволяет проводить ана­логичный процесс in vitro, то есть в пробирке.

Основные положения амплифи­кации ДНК in vitro были обосно­ваны сотрудником корпорации «Cetus» (США) Кэрри Маллисом в 1983 году. Через 10 лет за эту раз­работку он был удостоен Нобелев­ской премии по химии.

Достоинства и преимущества ПЦР-диагностики инфекцион­ных заболеваний

Метод прямой и позволяет дос­тичь предельно возможной чувстви­тельности: от одного до нескольких возбудителей в пробе. Специфич­ность метода составляет 99-100 процентов. Для ПЦР-анализа приго­ден любой материал, в том числе и гистологические препараты. Коли­чество исследуемого материала, как правило, составляет несколько десятков микролитов. Высокая чувствительность метода позволяет контролировать эффективность проводимого лечения. ПЦР успеш­но используется при диагностике труднокультивируемых и некультивируемых возбудителей, а также хронических, латентных и персистентных форм инфекции. Длитель­ность анализа не превышает 5-6 часов.

Но наряду с достоинствами име­ется определённый недостаток, ко­торый можно охарактеризовать как технологический. Подразумеваются повышенные требования к оснаще­нию лаборатории, качеству тест-на­боров и строжайшее соблюдение регламента исследования во избе­жание получения ложных результа­тов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответ­ствующей квалификации персона­ла и обязательной сертификации лаборатории.

Разработка методик и испытание приборов и оборудования — один из этапов большой работы по внед­рению ПЦР-методов в практику ди­агностических лабораторий. В связи с возрастающим интересом к ПЦР-диагностике внедрение её методов в систему государственной ветери­нарной службы — дело сегодняш­него дня. Необходимо отметить, что перспективными направлениями являются определение антибиотикорезистентности клинических штаммов возбудителей, возмож­ность количественного учёта ре­зультатов для контроля динамики инфекционного процесса, правиль­ного выбора тактики лечения и оценки эффективности применяе­мых лекарственных средств.

К настоящему времени ветери­нарными специалистами уже раз­работаны тест-системы для диагнос­тики методом ПЦР таких заболева­ний, как туберкулёз, сибирская яз­ва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чу­ма свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, ин­фекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь; чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др.