Раздел IV биологические мембраны, Энергетический обмен.

ЗАНЯТИЕ 9

ТЕМА: Биологические мембраны.

ЦЕЛЬ: Изучить структурную организацию, функции и свойства биологических мембран.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Состав биологических мембран.

2. Строение биологических мембран.

3. Основные свойства биомембран (ассиметрия, полупроницаемость, текучесть, самосборка).

4. Транспорт веществ через мембраны.

5. Трансмембранная передача сигнала.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. фосфатидилхолин 10%-ный спиртовый раствор

2. холестерин 0,5%-ный спиртовый раствор

3. хлорид калия 5, 50,100мМ растворы

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Получение липосом в качестве моделей исследования свойств биологических мембран.

Принцип метода: Полярные липиды в водной фазе структурируются таким образом, чтобы гидрофобные участки молекул были спрятаны от воды. При этом могут образовываться мицеллы или бислой, состоящий из двух рядов молекул липидов, обращенных друг к другу своими гидрофобными участками. При перемешивании сплошной бислой может распадаться и образовывать замкнутые везикулы, внутри которых находится вода, а стенки этих везикул состоят из липидного бислоя. Такие структуры представляют простейшую модель клетки и называются липосомами. В гипотонических растворах вода стремится внутрь липосом и они разбухают, а в гипертонических растворах липосомы сморщиваются за счет выхода воды из липосом. Колебания объема липосом зависят от липидного состава. Их можно наблюдать фотоколориметрическими измерениями.

Ход работы: Отмерить в одну пробирку 0,4 мл фосфатидилхолина, а в другую 0,2 мл фосфатидилхолина и 0,2 мл холестерина. Обе пробирки помещают в водяную баню и выпаривают растворы, затем к осадку липидов добавляют по 1 мл 50 мМ раствора хлорида калия и интенсивно встряхивают до получения молоковидной суспензии липосом. Отбирают из каждой пробирки по 0,2 мл суспензии липосом и добавляют в пробирки с 4,8 мл гипотоничного (5 мМ) и гипертоничного (100 мМ) раствора хлорида калия. Тщательно встряхивают пробирки и через 10 мин измеряют оптическую плотность при 440 нм.

Делают выводы по работе.

 

ЗАНЯТИЕ 10

ТЕМА: Энергетический обмен. Цепь переноса электронов.

ЦЕЛЬ: Изучить как осуществляется обмен веществ и энергии в клетке и какова структурная организация цепи переноса электронов.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Основные этапы обмена веществ. Эндэргонические и экзэргонические реакции.

2. Тканевое дыхание.

3. Роль АТФ в качестве универсального аккумулятора и поставщика энергии в клетке.

4. Структурная организация ЦПЭ.

5. Механизм окислительного фосфорилирования. Хемиосмотическая теория Митчела.

6. Дыхательный контроль.Разобщители тканевого дыхания.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. Рибофлавин 0,025%-ая суспензия

2. Метиленовый синий 0,01%-ный раствор

3. Соляная кислота концентрированная

4. Цинк гранулированный

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Сопоставление редокс-потенциалов рибофлавина и метиленового синего.

Принцип метода: В живых организмах наиболее важными донорами электронов служат атомы водорода органических молекул. При помощи переносчиков электронов осуществляется сложная последовательность реакций тканевого дыхания. Вещество с большим окислительно-восстановительным потенциалом (редокс-потенциалом) окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительным потенциалом.

Для определения окислительно-восстановительных состояний часто используют колориметрический метод, наблюдая изменение окраски специальных редокс-индикаторов. Причем для каждого индикатора зона перехода связана с характерной для него величиной окислительно-восстановительного потенциала. Например, для метиленового синего редокс-потенциал составляет +0,011 В, а для рибофлавина -0,208 В. Из этого следует, что метиленовый синий, обладая более высоким окислительно-восстановительным потенциалом, способен окислить рибофлавин. Обычно в восстановленном состоянии эти индикаторы бесцветны, а в окисленном обладают определенной окраской: метиленовый синий - синей, а рибофлавин - желтой.

Ход работы: В пробирку наливают 5-6 капель воды, 1 каплю суспензии рибофлавина и по каплям добавляют раствор метиленового синего до появления синего или зеленовато-синего окрашивания смеси. Затем в смесь бросают кусочек цинка и капают 1 каплю концентрированной соляной кислоты. Выделяющийся водород восстанавливает метиленовый синий и рибофлавин. Метиленовый синий востанавливается быстрее, поэтому цвет смеси становится сначала зеленым, затем зеленовато-желтым и, наконец, бледно-желтым или розоватым.

Слабо окрашенную жидкость сливают в другую пробирку. При этом в отсутствие водорода восстановленный рибофлавин через метиленовый синий передает электроны и ионы водорода на кислород воздуха и раствор желтеет. После этого происходит окисление восстановленного метиленового синего и раствор становится сначала зеленым, а потом синим.

Делают выводы по работе.

 

 

ЗАНЯТИЕ 11

ТЕМА: Энергетический обмен. Общий путь катаболизма - цикл трикарбоновых кислот.

ЦЕЛЬ: Изучить реакции цикла трикарбоновых кислот, в ходе которых происходит восстановление НАД и ФАД, обеспечивающих транспорт электронов по дыхательной цепи, а также образование конечных продуктов распада.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Цикл трикарбоновых кислот(цикл Кребса) - общий путь катаболизма белков жиров и углеводов.

2. Химические реакции цикла Кребса и их характеристика.

3. Коферменты и ферменты, участвующие в катализировании реакций цикла Кребса.

4. Энергетический эффект цикла Кребса.

 

Оснащение занятия:

 

Реактивы: 1. Мышечная кашица

2. Метиленовый синий 0,01%-ный раствор

3. Цитрат натрия 3%-ный раствор (нейтрализованный по лакмусу)

4. Сукцинат натрия 3%-ный раствор (нейтрализованный по лакмусу)

5. Сульфосалициловая кислота 20%-ный раствор

6. Вазелиновое масло или керосин

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Обнаружение дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот.

Принцип метода: Дегидрогеназы цикла трикарбоновых кислот, например, изолимонной(изоцитрат) и янтарной(сукцинат) кислот можно обнаружить в тканях, беря в качестве субстрата соответствующие кислоты, а в роли акцептора водорода - метиленовый синий, по обесцвечиванию которого можно судить об активности этих ферментов. Коферментом изоцитратдегидрогеназы является НАД, а коферментом сукцинатдегидрогеназы - ФАД. Восстанавливаясь эти коферменты будут отдавать водород на метиленовый синий, восстанавливая его до бесцветного лейкосоединения.

Ход работы: В 3 пробирки вносят равные количества мышечной кашицы. В первую пробирку добавляют 10 капель цитрата натрия, во вторую - 10 капель сукцината натрия, в третью - 10 капель сульфосалициловой кислоты. Если в мышечной кашице имеются пузырьки воздуха, их удаляют стеклянной палочкой.

В каждую пробирку добавляют по капле раствора метиленового синего и по 10 капель вазелинового масла или керосина для предотвращения окисления восстановленного метиленового синего кислородом воздуха. Пробирки инкубируют при 37°С. Отмечают постепенное обесцвечивание метиленового синего в пробирках с сукцинатом и цитратом. В пробирке с сульфосалициловой кислотой обесцвечивания метиленового синего не происходит в результате инактивирования ферментов кислотой.